Metodi rapidi di microbiologia: quali sono i vantaggi e come convalidare un metodo?

Ultimo aggiornamento: 2 mesi fa

Riferimenti normativi

European Pharmacopoeia Chapter <5.1.6> “Alternative Methods For Control Of Microbiological Quality”.


Nel capitolo 5.1.6 della Farmacopea Europea vengono descritti i nuovi metodi microbiologici applicabili in ambito farmaceutico.
Per ogni metodo viene descritto il principio di base e vengono indicati i benefici e gli svantaggi delle diverse metodiche.
Inoltre vengono fornite le raccomandazioni per la loro convalida.
Dunque questo capitolo può essere utilizzato per la scelta di un metodo microbiologico alternativo.

Esistono 3 tipi principali di determinazioni microbiologiche:

  • Test qualitativo (presenza/assenza di microrganismi)
  • Test quantitativi (per il conteggio dei microrganismi)
  • Test di identificazione

Test qualitativi: Metodi Base di Crescita

  • Basati sulla diagnosi precoce di crescita: strettamente dipendenti dai tempi di crescita dei microrganismi.
    Vantaggio rispetto al metodo classico: capacità di elaborare simultaneamente un gran numero di campioni e ottenere un risultato in tempi più brevi.
  • Elettrochimici: basati sulla capacità di rilevare una variazione dell’impedenza elettrica. Per l’applicazione di tali metodi vengono utilizzati elettrodi in grado di rilevare minime variazioni di impedenza nei campioni da testare.
  • Misurazione del consumo o di produzione di gas: basati sulla capacità di misurare le variazioni di gas derivanti dal metabolismo microbico, in seguito all’utilizzo di specifiche sostanze contenute nei terreni colturali.
  • Bioluminescenza:misurano la quantità di ATP presente su una superficie o in un liquido. Si misura con un bioluminometro la quantità di luce emessa, che è direttamente proporzionale alla quantità di ATP della superficie/liquido.
    In presenza di un alto livello di contaminazione microbica (500–1000 UFC) l’individuazione può essere rapida (1 h).
    Per livelli di contaminazione inferiori a 100 UFC è necessario aumentare il tempo di incubazione.
  • Microcalorimetria: la produzione di calore può essere rilevata ponendo il campione contaminato in una fiala sigillata contenente un brodo di crescita che racchiude all’interno un calorimetro.
  • Turbidimetria: basata sui cambiamenti dell’opacità media. La misurazione è effettuata mediante uno spettrofotometro standard, su un intervallo di lunghezze d’onda generalmente compreso tra 420–615 nm.
    Criticità del metodo: non si può distinguere tra microrganismi vitali e non vitali.
  • Tecniche basate sull’utilizzo dei fagi: virus batterici possono infettare cellule ospiti e causare lisi oppure integrazione del loro materiale genetico con conseguente produzione di nuove proteine. Il loro elevato livello di specificità con l’ospite può essere utilizzato in metodi di rilevamento che sfruttano le conseguenze di infezioni.
  • Sviluppo di terreni selettivi per facilitare la ricerca di microrganismi specifici: i terreni di coltura cromogeni permettono di rilevare la presenza di enzimi specifici utilizzando substrati adatti. L’incorporazione di specifici substrati nei terreni di isolamento primario permette di eliminare l’esecuzione di ulteriori subcolture e test biochimici per identificare i microrganismi.
    I terreni di coltura cromogenici, liquidi o solidi, sono stati progettati per produrre specifiche attività enzimatiche per l’individuazione e la differenziazione dei microrganismi.
    I tempi di risposta sono più brevi perché la crescita e l’identificazione del microrganismo sono simultanei.

Tutti questi metodi prevedono un tempo di incubazione e rilevano una crescita molto prima di un metodo microbiologico classico.

Test quantitativi: Misura Diretta

  • Citometria in fase solida: i microrganismi devono essere marcati (es. con un fluoroforo). Il fluoroforo coniugato con un idoneo substrato permette il rilascio della parte fluorescente.
    Aspetti critici:
    – per consentire l’individuazione delle spore è necessaria la germinazione delle stesse.
    – possono verificarsi falsi positivi possono verificarsi a causa dalle particelle auto-fluorescenti difficilmente differenziabili dai microrganismi.
  • Citometria a flusso: la citometria a flusso può essere applicata sia per l’analisi microbiologica di materiali filtrabili sia non-filtrabili. Il citometro a flusso esamina le cellule in sospensione mentre fluiscono di fronte a una sorgente di luce (preferibilmente una luce laser).
  • Tecnica diretta di filtrazione epifluorescenza (DEFT): il liquido contenente i microrganismi viene filtrato su una membrana che trattiene le cellule. Colorando con fluoresceina e osservando in epifluorescenza è possibile distinguere cellule vive e morte, che assumono colori diversi.

Identificazione

  • Fenotipica
    – Metodi immunologici
    – Profili degli acidi grassi
    – Spettroscopia (FTIR)
    – Spettrometria di massa
    – Saggi biochimici basati su reazioni fisiologiche
  • Genotipica
    – tecniche di amplificazione dell’acido nucleico
    – impronte genetiche

Requisiti Generali di Convalida dei metodi rapidi

La convalida dei metodi microbiologici rapidi deve avvenire per confronto con i metodi convenzionali.
Se vengono utilizzate delle apparecchiature per l’applicazione del metodo alternativo, compresi hardware e software, devo essere qualificate.

Quali sono le fasi della qualifica?

  • Qualifica di progettazione (DQ): si raccolgono prove documentate dal fornitore sulla corretta progettazione delle apparecchiature per lo svolgimento delle operazioni per cui la macchina è stata creata.
  • Qualifica di installazione (IQ): si raccolgono prove documentate che l’apparecchio è stato fornito e installato in conformità con le specifiche.
  • Qualifica operativa (OQ):si raccoglie prova documentata che l’apparecchiatura installata operi entro limiti predeterminati quando viene utilizzata conformemente alle sue procedure operative.
  • Qualificazione delle prestazioni (PQ): si raccolgono prove documentate che le attrezzature operino costantemente in base a criteri predeterminati.

Convalida dei test qualitativi

Per la convalida dei test qualitativi devono essere valutati i seguenti parametri:

  • Accuratezza e precisione
  • Specificità, ovvero la capacità di riconoscere diversi microrganismi all’interno di miscele di ceppi
  • Limite di rivelazione, ovvero il più basso numero di microrganismi in un campione che può essere rilevata nelle condizioni sperimentali previste
  • Robustezza, ovvero la capacità del metodo di non essere influenzato da piccole variazioni dei parametri, fornisce un’indicazione di affidabilità del metodo.

Convalida dei test quantitativi

Per la convalida dei test quantitativi devono essere valutati i seguenti parametri:

  • Accuratezza, ovvero la vicinanza quantitativa dei risultati dei test ottenuti con il metodo alternativo confrontato con il valore ottenuto con il metodo di farmacopea
  • Precisione
  • Specificità, ovvero la capacità di riconoscere diversi microrganismi all’interno di miscele di ceppi
  • Limite di quantificazione, ovvero il più basso numero di microrganismi che possono essere contati con precisione
  • Linearità, ovvero la capacità di produrre risultati che sono proporzionali alla concentrazione di microrganismi presenti nel campione in un certo range
  • Range
  • Robustezza, ovvero la capacità del metodo di non essere influenzato da piccole variazioni dei parametri, fornisce un’indicazione di affidabilità del metodo.

Convalida dei test di identificazione

Per la convalida dei test di identificazione devono essere valutati i seguenti parametri:

  • Accuratezza, ovvero la capacità di identificare il microrganismo desiderato sino al livello tassonomico richiesto
  • Precisione
  • Robustezza, ovvero la capacità di individuare specifici microrganismi anche quando vi sono variazioni nei parametri di un metodo.

Conclusioni

Prima di decidere se applicare o meno i metodi rapidi di microbiologia è opportuno effettuare una valutazione del rapporto costo/beneficio e valutare l’applicabilità stessa del metodo.
Per convalidare tali metodi è sempre necessario effettuare un confronto con i metodi ufficiali di Farmacopea.


Si ringrazia il Dr. Luca Rancati per il materiale fornito

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